HPLC OSZLOP választás

A módszernek megfelelő oszlop kiválasztása nagyon fontos, ugyanakkor nehéz döntés lehet.
Néhány egyszerű lépéssel meghatározhatjuk mire van szükségünk, és méréseink is pontosabbak lesznek.

1. Elválasztási célok meghatározása

Nagy felbontásra vagy maximális érzékenységre van szüksége? Mennyire fontos az elemzési idő? Ezeket a fő kérdéseket kell  figyelembe kell venni egy HPLC módszer kifejlesztésénél. Szintén meg kell határozni, hogy milyen tényezők fontosak még, például kolonna élettartam, alacsony üzemeltetési költség, stb.

2. Töltet kiválasztása

A leginkább megfelelő töltet kiválasztása a vegyületek jellegétől és az elválasztás céljától függ. A jól megválasztott töltettel jó szelektivitást lehet elérni relatíve rövid  elválasztási idő mellett.

3. Formátum kiválasztása

Az analitikai, a Semi-Prep vagy a Prep formátum választás az alkalmazásától és a céloktól függ. A belső átmérő és a hossz is hatással lesz az elválasztás eredményére.

Töltet

A polimer alapú töltetek, mint a polisztirol-divinilbenzol, vagy a metakrilát nagyobb pH stabilitást nyújtanak (1-14), mint a szilika alapúak, így az ezekkel töltött oszlopok tökéletesen tisztíthatók erős savakkal vagy bázisokkal. Viszont ezek a töltetek összenyomhatóak, zsugorodhatnak, vagy duzzadhatnak bizonyos oldószerek hatására, és nem adnak olyan felbontást, mint a szilika alapú töltetek.

A szilika alapú töltetek fizikailag sokkal erősebbek, nem duzzadnak és zsugorodnak. Nagyobb a felbontásuk, és élesebb csúcsokat adnak a polimer alapú töltetekhez képest. A kötött fázisok nagy választékát kínálják, a lehető legtöbb alkalmazáshoz biztosítják a legszélesebb szelektivitási tartományt. A szilika alapú töltetek kompatibilisek poláris és apoláris oldószerek széles skálájával és stabilak lehetnek nagy pH tartományon belül.

Részecske alak

A szilika alapú részecskék lehetnek szabálytalan alakúak, szferoid (csaknem gömb alakú), illetve gömb alakúak. A legtöbb modern HPLC töltet részecskéi gömb alakúak.

A gömb alakú részecskék kisebb nyomásesést eredményeznek, jobb a teljesítményük, stabilitásuk és reprodukálhatóságuk, mint a szabálytalan részecskéknek.

A szabálytalan részecskéknek nagyobb a fajlagos felülete, terhelhetőbbek és olcsóbbak. Ezen tulajdonságok miatt még most is általánosan használatban vannak preparatív és ipari méretű tisztítási eljárásoknál.

Részecske méret

A kisebb szemcseméret nagyobb hatékonyságot és felbontást ad, mint a nagyobbak, de nagyobb nyomásesést eredményez. A nagyobb részecskék gyorsabb áramlást és kisebb nyomásesést adnak. Az analitikai alkalmazásoknál általában 1.5μm és 10μm átmérő közötti szemcseméretet használnak, de a leggyakrabban alkalmazott a 3μm és 5μm;  ezek nyújtják a legjobb kompromisszumot a hatékonyság és a nyomáseseés között.

Preparatív alkalmazásoknál általában nagyobb szemcseméretű tölteteket használnak  (10μm – 30μm).

Széntartalom

A szilika alapú fordított fázisú töltetek esetében a széntartalom (%) jelzi a szilikához kötött fázis mennyiségét.
Az alacsonyabb széntartalom azt jelzi, hogy a töltet kevésbé hidrofób, amely kisebb retenciós időket eredményezhet a magasabb széntartalmú fázisokhoz képest. Azonban a magasabb széntartalom nagyobb kapacitást nyújt, és gyakran jobb elválasztást, különösen a hasonló hidrofóbicitású vegyületek esetében.

Pórusméret és felület

Pórusméret: A kisebb pórusú töltetek nagyobb fajlagos felülettel rendelkeznek, ebből következően nagyobb a kapacitásuk, mint a nagyobb pórusúaknak. A töltet és a cél molekulák kölcsönhatását a pórusméret megfelelő megválasztásával maximalizálhatjuk. Általában a 100Å pórusméretű töltet jó eredményeket ad kis molekulák elválasztásánál. Nagyobb molekulákra, pl. Proteinekre és peptidekre általában 300Å töltetet használnak.

Felület: A felület a cél molekulákkal való kölcsönhatásra  elérhető összes felület, amelynek nagy része a pórusokban van. Általában a kisebb pórusok nagyobb, míg a nagyobb pórusok kisebb felületet jelentenek.

Bonding

A legtöbb, kereskedelemben kapható fordított fázisú HPLC töltet monomer, vagy polimer kötött fázis. Amikor egy monofunkciós alkilszilán reagenst használnak a töltet elkészítésénél, a funkciós csoportok különálló pontokon kapcsolódnak a szilikához. Ezek a momomer kötött fázisok. Amennyiben di- és trifunkciós alkilszilán reagenseket használnak, akkor a funkciós láncoknak több kapcsolódási pontjuk is van, esetleg keresztkötések is lehetnek a láncok közt. Ezek a polimeren kötött fázisok. Az új, nagy tisztaságú szilika állófázisok nagyon stabilak, akár monomeren vagy polimeren kötöttek, azonban szelektivitásuk különbözik.

Endcapping

A szilika alapú fordított fázisú töltetek gyártásánál a  fázis  felkötési folyamatai után a szabad szilanol csoportok egy része reagálatlan marad a szilika felületen. Ezek a csoportok kölcsönhatásba lépnek a poláros vegyületekkel. A fázis endkeppelése minimalizálja ezeket a másodlagos kölcsönhatásokat. A részleges, vagy teljes endkeppelés a szabad szilanolok mennyiségét csökkenti le a szilika felületén. Amennyiben ez nagyobb mértékű, kisebb lesz a kölcsönhatás a poláros vegyületekkel, a nem endkeppelt fázisok növelt poláros szelektivitást adnak, nagyobb retenciót eredményeznek a poláros szerves vegyületek esetében.

Tekintse meg HPLC oszlop kínálatunkat!

MZ-Analysentechnik »  Thermo Scientific »  Sepachrom »  Dr. Maisch »  Shodex »

Cégünkről

Ceginformáció megbizhatósági tanusitvány

Elérhetőségek

1087 Budapest,
Asztalos Sándor u. 5-6.

+36 30 922 85 18
+36 30 966 65 36
+36 20 491 72 54

info@bioszeparacio.hu